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用CCK-8检测VEGF刺激原代HUVEC细胞的生长曲线 (2015-8-24)
 
如果您做原代细胞,想尝试用CCK-8检测,可以向我们申请CCK-8 100孔样品。
 
一、实验目的:用CCK-8检测VEGF刺激原代HUVEC细胞的生长曲线,确定该批次细胞反应的C值。

二、实验材料:

CCK-8试剂(同仁化学研究所(Dojindo))

HUVEC细胞(HUVEC-001,澳赛尔斯生物技术(上海)有限公司)

HUVEC完全培养基(HUVEC-004,澳赛尔斯生物技术(上海)有限公司)

HUVEC基础培养基(HUVEC-004B,澳赛尔斯生物技术(上海)有限公司)

VEGF165刺激因子(R&D公司)

三、实验前准备工作:

3.1.VEGF稀释

库存10μg/支的VEGF,加入1ml的基础培养基,得到10μg/mlVEGF

10μl原液加入990μl基础培养基,得到B

500μlB,加入500μl基础培养基,得到C

依次类推(共10个浓度梯度)

Tube

终浓度Nominal Concentration (ng/ml)

Volume of rhVEGF Dilution (μl)

Volume of HUVEC Assay Diluent

A

~10 μg/mL

-

-

B

100

10μl of A

990μl

C

50

500μl of B

500μl

D

25

500μl of C

500μl

E

12.5

500μl of D

500μl

F

6.25

500μl of E

500μl

G

3.125

500μl of F

500μl

H

1.563

500μl of G

500μl

I

0.781

500μl of H

500μl

J

0.391

500μl of I

500μl

K

0

--

1000μl

3. 2. 按照完全培养基:基础培养基=1:32,配置新培养基用于细胞培养。

四、实验步骤:

4. 1. 消化HUVEC细胞计数,用新鲜培养基稀释细胞至5×104 cells/ml

        4. 2. 96孔板每孔加入  1100μl细胞悬液+100μlVEGF溶液的实验组,每组三个复孔。

                        (2)设置只含培养基不含细胞的对照组。

                        (3)外围每孔加入50μlDPBS

4. 3. 培养4天并确认无污染后,每孔加入CCK-8(用培养基稀释CCK-8一倍,即每孔加入20μlCCK-8工作液),分别反应2小时和4小时后,用酶标仪检测(检测波长450 nm)。

4. 4.软件作图。

五、实验结果分析:

5.1 实验成立条件

5.1.1 四参数相关系数(R2)值> 0.9

5.1.2四参数曲线近似“S”形, OD450的最大值与最小值之间差均 ≥0.3