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细胞活死双染说明书 (2013-5-24)
活死细胞双染试剂
 
产品名称            货号           规格           储存条件            运输条件
Calcein-AM       C326         1 mg                   -20                 室温或蓝冰
PI                        P346         1 mg                   -20,避光     室温
 
 
产品描述

钙黄绿素-AM (Calcein-AM) 和碘化丙啶 (PI) 溶液,分别对活细胞和死细胞染色,可用于同时对活细胞和死细胞进行荧光染色。Calcein-AM的乙酸甲酯亲脂性很高,使其可透过细胞膜。尽管Calcein-AM本身并不是荧光分子,但通过活细胞内的酯酶作用,Calcein-AM能脱去AM基,产生的Calcein能发出强绿色荧光 (激发: 490 nm,发射: 515 nm)。因此Calcein-AM仅对活细胞染色。另一方面,作为核染色染料的PI不能穿过活细胞的细胞膜。它穿过死细胞膜的无序区域而到达细胞核,并嵌入细胞的DNA双螺旋从而产生红色荧光 (激发: 535 nm,发射: 617 nm)。由于Calcein和PI-DNA都可被490 nm激发,因此可用荧光显微镜同时观察活细胞和死细胞。用545 nm激发,仅可观察到死细胞。由于不同细胞系的最佳染色条件不同,我们建议个别确定Calcein-AM和PI的合适浓度。
染色原理

 
 
 

用荧光显微镜观察细胞形态
 
HeLa细胞染色为例,请注意不同的细胞种类、不同浓度,有不同的观察条件。根据细胞种类,摸索不同条件下的细胞贴壁情况和试剂浓度的配制等最佳条件。
1. 染色溶液的配制
1) 1 ml无水DMSO溶解1 mg Calcein-AM,制备成1 mmol/lCalcein-AM储备液,-20下密闭保存。
2) 1 ml ddH2O溶解1 mg PI,制备成1.5 mmol/lPI储备液 (1 mg PI/1 ml H2O)-20下密闭保存。
 注:以上Calcein-AMPI的储备液建议根据具体情况分装保存,以免因为反复冻融影响实验效果。
3) Calcein-AM储备液和PI储备液放置于室温,确保完全溶解后使用。
4) 10 µl Calcein-AM储备液和15 µl PI储备液至5 ml PBS中配制成染色溶液。Calcein-AM的终浓度为2 µmol/lPI的终浓度为4 µmol/l
2. 细胞染色
方法一:
1) 染色HeLa细胞等贴壁细胞时,先用Trypsin-EDTA等消化细胞,制备成细胞悬液。
2) 将细胞悬液离心3分钟 (1,000 rpm)
3) 去除上清液,加入PBS缓冲液,细胞数量调整至105-106/ml。再用移液器充分混匀。
4) 由于培养基中的血清等含有酯酶,Calcein-AM酯酶会分解,会导致空白上升,所以需要离心数次,用PBS洗涤数次直到完全洗净。
5) 将200 µl细胞悬液移至小试管中,加入100 µl染色溶液,在37℃培养箱孵育15分钟。
6) 在盖玻片上滴加适量的染色的细胞溶液。
7) 在荧光显微镜下,先用490±10 nm波长激发,观察黄绿色的活细胞,还可以同时观察到红色的死细胞,然后用545 nm波长激发,能够看到红色的死细胞。
方法二:
1)    在合适的细胞培养板上预接种HeLa细胞,细胞完全贴壁后待用。
注:如果细胞还需加药处理或其他操作,请在第一步细胞贴壁后进行,然后继续第二步操作。
2)    吸走第一步HeLa细胞的培养基。
3)    由于培养基中的血清等含有酯酶,Calcein-AM遇酯酶会分解,会导致空白上升,所以需要用PBS洗涤数次直到完全洗净。
4)    加入配好的Calcein-AM和PI染色工作液,加入体积以覆盖细胞为准。
5)    37℃培养箱孵育15分钟。
6)    在荧光显微镜下,先用490±10 nm波长激发,观察黄绿色的活细胞,还可以同时观察到红色的死细胞,然后用545 nm波长激发,能够看到红色的死细胞。。
注:贴壁细胞:以上两种染色方法请根据具体情况和个人实验习惯等自行选择,以达到最好的实验效果。
悬浮细胞:细胞预接种后,离心去除培养基,用PBS洗涤3次,调整细胞数目后直接进行染色。操作同上。
 
3. 染色试剂的最佳浓度
Calcein-AM和PI的最佳浓度是根据不同的细胞种类而定,通过以下的操作,我们可以找到不同细胞染色试剂的最佳浓度。
1) 通过在0.1%皂苷或0.1-0.5%毛地黄皂苷中孵育10分钟或通过在70%乙醇中孵育30分钟制备死细胞。
2) 用0.1-10 µM PI溶液对死细胞染色,以便找到仅对细胞核染色而不对细胞质染色的PI浓度。
3) 用0.1-10 µM Calcein-AM溶液对死细胞染色,以便找到不对细胞质染色的Calcein-AM浓度。接着用该浓度的Calcein-AM对活细胞染色以检验活细胞可否被染色。
 
 
注意事项
1) Calcein-AMester部位遇到湿气会分解,使用后请在-20℃下密闭保存,防止水分进入。Calcein-AM储备液用缓冲液或培养基等稀释时尽量现配现用。
2) PI溶液在冷冻的条件下可以保存一年。PI有致癌的可能性,请在使用时注意以下3点:
* 使用时一定要带手套、眼罩、口罩。
* 万一接触到皮肤的话,迅速使用大量水清洗。
* 处理方法
使用器具的洗涤液等废液请按照不同的处理方法来处理,或者按照如下的处理方法,分解后再丢弃。用UV照射或光照分解,用次氯酸钠氧化分解后,做中和处理