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如何进行活细胞、死细胞的双重染色 (2009-12-21)

钙黄绿素-AM (Calcein-AM) 和碘化丙啶 (PI) 溶液,分别对活细胞和死细胞染色,可用于同时对活细胞和死细胞进行荧光染色。Calcein-AM的乙酸甲基酯亲脂性很高,使其可透过细胞膜。尽管Calcein-AM本身并不是荧光分子,但通过活细胞内的酯酶作用,Calcein-AM能脱去AM基,产生的Calcein能发出强绿色荧光 (激发: 490 nm,发射: 515 nm)。因此Calcein-AM仅对活细胞染色。另一方面,作为核染色染料的PI不能穿过活细胞的细胞膜。它穿过死细胞膜的无序区域而到达细胞核,并嵌入细胞的DNA双螺旋从而产生红色荧光 (激发: 535 nm,发射: 617 nm)。由于CalceinPI-DNA都可被490 nm激发,因此可用荧光显微镜同时观察活细胞和死细胞。用545 nm激发,仅可观察到死细胞。由于不同细胞系的最佳染色条件不同,我们建议个别确定Calcein-AMPI的合适浓度。

 

I. 试剂

·Calcein-AM

·PI

 

II. 用荧光显微镜观察细胞形态

HeLa细胞染色为例,请注意不同的细胞种类、不同浓度,有不同的观察条件。根据细胞条件,摸索不同条件下的细胞贴壁情况和试剂浓度的配制等最佳条件。

 

1. 染色溶液的配制

1) 1 ml无水DMSO溶解1 mg Calcein-AM,制备成1 mmol/lCalcein-AM储备液,-20下密闭冷冻保存。

2) 1 ml ddH2O溶解1 mg PI,制备成1.5 mmol/lPI储备液 (1 mg PI/1 ml H2O)-20下密闭冷冻保存。

3) Calcein-AM储备液和PI储备液放置于室温。

4) 10 µl Calcein-AM储备液和15 µl PI储备液至5 ml PBS中配制成染色溶液。Calcein-AM的终浓度为2 µmol/lPI的终浓度为4 µmol/l

 

2. 细胞染色

1) 染色HeLa细胞等贴壁细胞时,先用Trypsin-EDTA等消化细胞,制备成细胞悬液。

2) 将细胞悬液离心3分钟 (1,000 rpm)

3) 去除上清液,加入PBS缓冲液,细胞数量调整至10e5-10e6/ml。再用移液器充分混匀。

4) 由于培养基中的血清等含有酯酶,Calcein-AM遇水会分解,会导致空白上升,所以需要离心数次,用PBS洗涤数次直到完全洗净。

5) 200 µl细胞悬液移至小试管中,加入100 µl染色溶液,在37下孵育15分钟。

6) 在盖玻片上滴加适量的染色的细胞溶液。

7) 在荧光显微镜下,先用490±10 nm波长激发,观察黄绿色的活细胞,还可以同时观察到红色的死细胞,然后用545 nm波长激发,能够看到红色的死细胞。

 

3. 染色试剂的最佳浓度

Calcein-AMPI的最佳浓度是根据不同的细胞种类而定,通过以下的操作,我们可以找到不同细胞染色试剂的最佳浓度。

1) 通过在0.1%皂苷或0.1-0.5%毛地黄皂苷中孵育10分钟或通过在70%乙醇中孵育30分钟制备死细胞。

2) 0.1-10 µM PI溶液对死细胞染色,以便找到仅对细胞核染色而不对细胞质染色的PI浓度。

3) 0.1-10 µM Calcein-AM溶液对死细胞染色,以便找到不对细胞质染色的Calcein-AM浓度。接着用该浓度的Calcein-AM对活细胞染色以检验活细胞可否被染色。

 

 

III. 注意事项

1) Calcein-AMester部位遇到湿气会分解,使用后请在-20下密闭冷冻保存,防止水分进入。Calcein-AM储备液用缓冲液或培养基等稀释时尽量现配现用。

2) PI溶液在冷冻的条件下可以保存一年。PI有致癌的可能性,请在使用时注意以下3点。

* 使用时一定要带手套、眼罩、口罩。

* 万一接触到皮肤的话,迅速使用大量水清洗。

* 处理方法

使用器具的洗涤液等废液请按照不同的处理方法来处理,或者按照如下的处理方法,分解后再丢弃。用UV照射或光照分解,用次氯酸钠氧化分解后,做中和处理。