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如何对有呼吸活性的细菌进行荧光染色 (2009-12-21)

I. 荧光图像法

以下方法为检测饮用水中的细菌染色的实例。某些样品,需要前处理。

1) 10 ml灭菌水溶解3.1 mg CTC,配制成1.0 mmol/l 的储备液。

*CTC在水溶液的状态不稳定,最好现配现用。详情请参考

II.测定CTC的染色能力的方法」

 

2) 4.0 ml R2A培养基加到5.0 ml样品水中,然后加入1.0 ml的储备液,在室温条件下孵育1个小时。

*不同的细菌种类CTC浓度和孵育时间也不一样。一般情况下CTC的终浓度约为0.5-5.0 mmol/l,孵育时间约为0.5-5个小时。参考这些条件,然后自己摸索,确定最合适的条件。

*液体培养基的种类要根据样品和细菌的种类来选择。有报道说R2A培养基是检测环境水中一般活菌的合适的培养基。

 

3) DAPI染色细胞 (对比染色)。加入终浓度为1.0 µg/mlDAPI溶液,在室温条件下孵育5分钟。

 

4) 用孔径为0.20 µm的黑色聚碳酸酯过滤膜吸附过滤3)的样品溶液,收集细菌。

*若样品中的细菌细胞量过少,不能计数的话,请先过滤,在过滤膜上收集、浓缩样品中的细菌细胞,然后用含CTC的染色液浸泡过滤膜进行染色。

 

5) 风干过滤膜,用落射荧光显微镜观察。若需要计数,统计过滤膜上的复数视野内的细胞数量,取平均值。分别在不同的激发波长处观察CTCDAPI的染色情况。

*由于CTF存在2个最大激发波长,分别是在430 nm附近及480 nm附近,所以也可以用Ar激光 (488 nm) 来激发。发射波长约为620-640 nm。必要时可以用590 nm的截止滤光片去除自发荧光。

*由于CTF是沉淀的固体,所以在细胞内固定后很难漏出来。曾有报道利用这一特性,对于同一个样品可以同时进行CTC染色和荧光原位杂交。

 

LB培养基中培养细菌,加入等量的CTC水溶液 (10 mmol/l)混合,在室温条件下孵育6个小时,观察荧光。用590 nm的截止滤光片。

 

II. 测定CTC的染色能力的方法

CTC的水溶液在保存过程中染色能力会慢慢下降,特别是在碱性条件下不稳定。CTC遇水后会分解变成其它化合物,不会被呼吸活性还原,不发生颜色变化,所以储备液最好现配现用。由于CTC的分解率会根据pH和温度的变化而发生改变,故在使用前有时需要测定CTC的染色能力 (CTC含量)

测定CTC染色能力的方法如下:

1) 4.5 ml HEPES溶液 (20 mmol/l pH7.4) 加入到30 ml样品管中。

2) 加入500 µl CTC溶液 (1 mmol/l)

3) 加入5 µl 1-Methoxy-PMS水溶液 (5 mmol/l)

4) 加入200 µl NADH水溶液 (5 mmol/l),在25的条件下孵育3分钟。

*由于NADH不稳定,所以水溶液要在使用前现配。另外,配制后的水溶液要浸在有冰块的容器中,在使用前保持冷却状态。

5) 加入15 ml DMSO,溶解第4)步产生的CTF

6) DMSO (20 mmol/l ): HEPES (pH 7.4) = 3: 1的混合液为空白对照,测定吸收光谱。在最大吸收波长 (470 nm附近)测定吸光度,计算含量。

*如果仅是想定性判断是否有染色能力的话,则可以省略第5)-6)步的操作,只需要确认是否有CTF析出就可以。

 

使用本公司及其他公司的CTC后,按如上方法测定的光谱