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如何测定膜电位 (2009-12-21)

I. 用荧光显微镜测定膜电位的方法

1. 试剂

·DiBAC4(3)

·Dulbecco’s MEM (DMEM)

·FBS (fetal bovine serum)

 

2. 方法

1) 将消化好的细胞移至DMEM中。

2) 加入FBS,控制浓度范围在:2-15%

3) 加入DiBAC4(3),控制浓度范围在:1-5 µmol/l

4) 用荧光显微镜观察刺激后荧光强度的变化。[Ar激光(488 nm) 的激光共聚焦显微镜 ],由于DiBAC4(3)的荧光会随温度变化而改变,所以必须在37的条件下测定。由于细胞膜的电位会变化,可以观察细胞质内的荧光强度变化。

 

 

II. 用酶标仪测定膜电位的方法

1. 试剂

·DiBAC4(3)

检测用缓冲液 (pH7.4; 20 mmol/l HEPES, 120 mmol/lNaCl, 2 mmol/l KCl, 2 mmol/l CaCl2, 1 mmol/l MgCl2,

5 mmol/l glucose)

 

2. 方法

1) 培养细胞:在微孔板中培养细胞

2) 清洗细胞:用含5 µmol/l DiBAC4(3) 的检测用缓冲液200 µl,清洗微孔板中培养的细胞2

3) 染色:在孔板中加入180 µl5 µmol/l DiBAC4(3) 的检测用缓冲液,在5%CO237培养箱中孵育30

分钟。

4) 测定:用荧光酶标仪观察刺激后荧光强度的变化。由于DiBAC4(3)的荧光会随温度变化而改变,所以必

须在37的条件下测定,加入20 µl DiBAC4(3) 的检测用缓冲液,每隔30秒测定1次荧光变化。

 

 

III. 膜电位的标准曲线

1. 原理

膜电位变化时色素的分布也随之变化,所以荧光和吸收也会变化。这种变化程度取决于色素的分子数和细胞数的比率、色素的浓度以及细胞的种类。膜电位的标准曲线是通过用电极直接测定目的细胞的膜电位,在该电位所测得的荧光和吸收强度而制得的。

 

2. 试剂

·DiBAC4(3)

·Eagle-Dulbecco medium

·PBS

 

3. 方法

1) Eagle-Dulbecco medium培养细胞。

2) PBS中的细胞在37CO2培养箱中孵育30-60分钟,然后改变孵育时间,制备不一样的CO2浓度的样品。

3) 加入DiBAC4(3),终浓度为2 µmol/l

4) 20分钟后,在517 nm测定各个浓度的荧光强度,并用电极直接测定此时的电位差。

5) 用荧光强度和对应的电位差来制作标准曲线。

 

4. 其他方法

有钾扩散电位和荧光或吸收强度比较的方法。缬氨霉素引起钾扩散电位,钾扩散电位 (V) 是按照Nernst 方程计算如下:

V= -RTF log[K+]in[K+]out = -59 log[K+]in[K+]out (mV)

 

所以在缬氨霉素存在时,通过改变细胞外钾离子浓度和细胞内钾离子浓度,计算扩散电位,测定各个电位的荧光或吸收强度,比较后可以得到标准曲线。