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如何提取膜蛋白 (2009-12-21)

 

I. n-Octyl-β-D-glucoside提取大肠杆菌乳糖输送体

1. 试剂

·lacY recombinant大肠杆菌T206制备的膜泡

·n-Octyl-β-D-glucoside

·胆酸钠 (Sodium cholate)

·Dithiothreitol (DTT)

·取自大肠杆菌的磷脂 (Avanti Biochem.公司)

·DEAE-Sepharose CL-6B (GE Healthcare公司)

·磷酸钾 (Potassium Phosphate)

·乳糖 (lactose)

·尿素 (生化级)

·磷酸

 

2. 方法

以下操作,在没有特指时的温度是指4,用Vortex mixer搅拌。

1) 要得到约10 mg的蛋白质,可以取外翻型膜泡 (inside-out vesicles) 12.5 mg,加入1 ml缓冲液 (50 mmol/l 磷酸钾,pH7.50.5 mmol/l DTT10 mmol/l乳糖)制成悬浊液。

2) 在室温条件下,边搅拌,边滴加等量的尿素溶液(10 mmol/l)

3) 在冰浴中放置10分钟后,在175,000× 的速度条件下离心1小时。

4) 沉淀用1.75 ml缓冲液 (50 mmol/l磷酸钾,pH7.5) 制成悬浊液。边搅拌,边加入胆酸钠溶液 (20%w/vpH7.8),终浓度为6%

5) 在冰浴中放置20分钟后,在26,000×g的速度条件下离心15分钟。

* 以上操作是为了去除膜中不需要的蛋白质。

6) 沉淀用5 ml缓冲液 (10 mmol/l磷酸钾,pH5.8) 制成悬浊液,离心,重复此步骤1-2次。

7) 沉淀用1.45 ml缓冲液 (10 mmol/磷酸钾,pH5.8) 制成悬浊液,加入17.5 l DTT溶液 (100 mmol/l)13 mg乳糖,131 l磷脂溶液 (50 mg/ml),搅拌均匀。 

8) 在上述溶液中加入146 µl n-Octyl-β-D-glucoside (15% w/v10 mmol/l磷酸钾,pH5.8),使终浓度为1.25%

蛋白质/磷脂/去垢剂的比例约为1:3:10

9) 搅拌时请注意不要起泡沫,在冰浴中放置10分钟后搅拌,然后在175,000× 的速度下离心1小时。

10) 取上清,用磷酸溶液 (10 mmol/l 磷酸, 1.25% n-Octyl-β-D-glucoside) 调节pH5.8

11) DEAE-Sepharose 纯化柱纯化1 ml蛋白质提取液 (含约300 µg 蛋白质)

溶出液:10 mmol/l 磷酸钾,pH5.81 mmol/l DTT20 mmol/l乳糖, 0.25 mg 磷脂/ml, 1.25%(w/v) n-Octyl-β-D-glucoside

 

II. n-Heptyl-β-D-thioglucoside提取肠炎弧菌的膜结合性 5'-核苷酸酶

1. 试剂

·采用French Pressure法制备的膜泡

·n-Heptyl-β-D-thioglucoside

·EDTA-2K

·Dithiothreitol (DTT)

·Tricine

·MOPS

·Tris

·氯化钠

·硫酸镁

·2-Mercaptoethanol

·DEAE-Sepharose CL-6B (GE Healthcare公司)

 

2. 方法

以下操作,在没有特指时的温度是指4

1) 取肠炎弧菌的的膜泡 (145 mg蛋白质) 30 ml缓冲液(3 mmol/l Tricine-TrispH8.00.5 mmol/l EDTA-2K1 mmol/l 2-Mercaptoethanol) 制成悬浊液。在冰浴中轻轻地搅拌约30分钟后,105,000×g离心1小时。

2) 加入含有n-Heptyl-β-D-thioglucoside 40 mmol/l的缓冲液(20 mmol/l MOPS-TrispH7.55 mmol/l硫酸镁、1 mmol/l DTT) 制成悬浊液,蛋白质浓度约为1 mg/ml。在冰浴中轻轻地摇匀约15分钟。

3) 105,000×g离心1小时,得到5'-核苷酸酶的上清。

4) DEAE-Sepharose 纯化柱纯化上清。溶出液:50 mmol/l MOPS-TrispH 8.05 mmol/l硫酸镁、1 mmol/l DTT40 mmol/l n-Heptyl-β-D-thioglucoside100→400 mmol/l (梯度)氯化钠

 

III. CHAPS提取巨噬细胞的细胞骨架

1.试剂

·S.typhimurium LPS (Difco公司)

·胎牛血清 (FBS)

·肝素 (heparin)

·Dulbecco's MEM (DMEM)

·Plasticcoverslip (SUMITOMO BAKELITE 公司、celldesk)

·PIPES

·HEPES

·GEDTA

·Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMASigma公司)

·氯化镁

·CHAPS (在硅胶干燥器中干燥约2周后使用)

 

2. 方法

1) 用灭菌蒸馏水将 S.typhimurium LPS配制成200 µg/ml。给小鼠 (SLC-ICR7-10周龄) 腹腔注射,剂量为0.25 ml/只。

2) 5-6天后,用10 mmol/l HEPES(添加10% FBS10 U/ml肝素、含DMEM pH7.1)洗净腹腔,收集细胞。

3) 4DMEM将贴壁的腹腔细胞离心洗净3 (1,000 rpm10分钟/)

4) 用含有10% FBSDMEM调节细胞浓度至10e6/ml,移至培养皿中。

5) 4的条件下,用FBS浸泡盖玻片一个晚上,然后用DMEM洗净10分钟,将盖玻片放入上述培养皿中。在CO2培养箱中37下孵育20分钟 (每一张盖玻片需要细胞液1 ml)

6) 将盖玻片一张一张放入4含有DMEM的培养皿中,用巴氏吸管吸掉非贴壁细胞。

7) 在含有10% FBSDMEM中加入稀释的PMA,在CO2培养箱中37下孵育20分钟。

8) 用室温DMEM将贴付着细胞的盖玻片洗净10分钟。

9) 用室温的PHEM 缓冲液 (60 mmol/l PIPES25 mmol/l HEPES10 mmol/l GEDTA2 mmol/l氯化镁、pH6.9)

清洗2 (10分钟/)

10) 预先将盖玻片放置在37PHEM缓冲液中约5分钟。

11) PHEM缓冲液配制0.5%CHAPS溶液*2,*3,取15 ml加入*4直径为6 cm的培养皿中,将盖子反过来盖在培养皿上,放置在37培养箱中。

将贴付着细胞的盖玻片放在如上的培养皿中(2张盖玻片/1个培养皿),放置3分钟后会露出细胞骨架,这时轻轻振摇培养皿45-60秒。

12) 37PHEM 缓冲液洗净3(分别为2-3分钟,10分钟,10分钟),清洗后放回到室温的PHEM 缓冲液里,细胞骨架样品制备完成。

*1 清洗不足的话,会降低细胞骨架露出率。

*2 CHAPS溶液要在使用前1小时内配制,混合时注意不要产生泡沫。CHAPS的浓度一定要准确地配制成0.5% (8.132 mmol/l )。如果浓度过高,会增加从盖玻片上掉落的细胞,一部分的细胞骨架会溶解下来。如果浓度过低,会导致细胞膜的溶解效果差。

*3 CHAPS的溶液量,1个直径13.5 mm的培养皿需要6 ml以上。

*4 请注意振摇过强的话,会增加细胞脱落。

 

IV. CHAPS从原生质体分离液胞

1. 试剂

·Atriplex gmelini的绿叶中制得的原生质体 (1.2 mol/l山梨糖醇中分离)

·CHAPS

·GEDTA (EGTA)

·HEPES

·山梨糖醇

·Tris

 

2.方法

1) 1 ml 原生质体放入巴氏瓶中*1

2) 加入50 ml缓冲液 (1.0 mol/l山梨糖醇、1 mmol/l GEDTA0.5 mmol/l CHAPS20 mmol/l HEPES-TrispH8.0)120×g离心3分钟。

3) 收集上清液中的液胞 (1.2 ml)*2,放入巴氏瓶中。

4) 用缓冲液 (1.0 mol/l 山梨糖醇、20 mmol/l HEPES-TrispH8.0) 稀释19倍。120×g离心3分钟, 回收上清液中悬浮的液胞。

*1 0.5 mol/l 山梨糖醇分离原生质体时,添加10% Ficoll 400等,使原生质体悬浮。

*2 原生质体的上清液不浓缩的话, 使用Ficoll 400等,需要提高溶液的比重。