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关于细胞凋亡荧光染料Hoechst 33342 /PI 双染 (2010-8-5)
关于Hoechst 33342
 
一、原理
正常情况下,荧光染料 Hoechst 33342 只有少量能透过细胞膜进入细胞,使其染上低蓝色。但是当细胞发生凋亡时,它的细胞膜通透性增强,因此进入凋亡细胞中的Hoechst 33342 比正常细胞的多,荧光强度要比正常细胞中要高。此外,凋亡细胞的染色体DNA 的结构发生了改变,从而使该染料能更有效地与DNA 结合,并且凋亡细胞膜上的p-糖蛋白泵功能受到损伤不能有效地将Hoechst 33342 排出到细胞外使之在细胞内积累增加等都使凋亡细胞的蓝色荧光增强。
 
二、激发波长和仪器
使用带有350nm激发波长和460nm发射波长的滤光片的荧光显微镜观察细胞。
 
三、毒性
Hoechst 33342对人体有害,请注意适当防护,操作时要十分小心,注意穿实验服并戴一次性手套
 
四、操作
1.对于固定的细胞或组织:
 
1)对于细胞或组织样品,固定后,适当洗涤去除固定剂。随后如果需要进行免疫荧光染色,则先进行免疫荧光染色,染色完毕后再按后续步骤进行Hoechst 33342染色。如果不需要进行其它染色,则直接进行后续的Hoechst 33342染色。
 
(2)对于贴壁细胞或组织切片,加入少量Hoechst 33342染色液,覆盖住样品即可。对于悬浮细胞,至少加入待测染色样品体积3倍的染色液,混匀。室温放置3-5分钟。
 
(3)吸除Hoechst 33342染色液,用TBSTPBS或生理盐水洗涤2-3次,每次3-5分钟。
 
(4)直接在荧光显微镜下观察或封片后荧光显微镜下观察。细胞发生凋亡时,会看到凋亡细胞的细胞核呈致密浓染,或呈碎块状致密浓染。
2
。对于活细胞或组织:
 
(1) 加入适当量Hoechst 33342染色液,必须充分覆盖住待染色的样品,通常对于六孔板一个孔需加入1ml染色液,对于96孔板一个孔需加入100微升染色液。
 
(2)在适宜于细胞培养的温度培养10-20分钟。弃染色液,用PBS或培养液洗涤2-3次即可进行荧光检测。
 
五、注意事项
(1)Hoechst 33342染色后的荧光会有淬灭现象,所以建议染色后在当天完成检测,放置时间不宜过长。
(2)一般情况下,Hoechst 33342染料的浓度推荐为10-50μM。
 
六、同仁化学Hoechst 33342的优点
(1)配制好的容液,减少操作步骤,减小对人体危害。该产品相对DAPI致癌性更小一下。
(2)可以和PI一起用于细胞凋亡检测,染色后可看出细胞凋亡情况:正常细胞为低蓝色/低红色(Hoechst 33342+/PI+),凋亡细胞为高蓝色/低红色(Hoechst33342++/PI+),坏死细胞为低蓝色/高红色(Hoechst 33342+/PI++)。
(3)对于活细胞,33342比33258穿透膜的能力更强一些。
(4)小包装适用于老师做量小的实验,不会造成试剂浪费。
 
 
细胞凋亡荧光Hoechst 33342 /PI 双染
一、原理
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荧光染料 Hoechst 33342 能少许进入正常细胞膜,使其染上低蓝色,而凋亡细胞的膜通透性增强,因此进入凋亡细胞中的Hoechst 33342 比正常细胞的多,荧光强度要比正常细胞中要高,此外,凋亡细胞的染色体DNA 的结构发生了改变从而使该染料能更有效地与DNA 结合,并且凋亡细胞膜上的p-糖蛋白泵功能受到损伤不能有效地将Hoechst 33342 排出到细胞外使之在细胞内积累增加等都使凋亡细胞的蓝色荧光增强。
2PI 染料是不能进入细胞膜完整的正常细胞和凋亡细胞中,即活细胞对PI 染料拒染,而坏死细胞由于膜完整性在早期即已破损,可被PI 染料染色。
3根据这些特性,用Hoechst 33342 结合PI 染料对凋亡细胞进行双染色,就可在流式细胞仪上将正常细胞、凋亡细胞和坏死细胞区别开来。在双变量流式细胞仪的散点图上,这三群细胞表现分别为:正常细胞为低蓝色/低红色(Hoechst 33342+/PI+),凋亡细胞为高蓝色/低红色(Hoechst33342++/PI+),坏死细胞为低蓝色/高红色(Hoechst 33342+/PI++)。
二、试剂材料
Heochst 33342
染液1.0mL
Propidium Iodide (PI)500 ul
10×PBS 10 mL
三、操作步骤
1.
悬浮生长的细胞离心收集,固定培养的细胞消化收集后,将105~106 个细胞悬浮于1ml 培养基中,再加入10ul Heochst 33342 染液,混匀,370C 孵育5-15 min;
2. 细胞于 40C 500 ~ 1000r/min 离心5min 弃去上清液;
3. 加入1.0ml PBS 悬浮细胞,加入5 ul PI 染液,避光混匀;
4流式细胞仪分析或荧光显微镜观察:Heochst 33342 用氪激光激发的紫外光,激发波长为352nm,发射波长为400 ~ 500nm,产生蓝色荧光;PI 用氩离子激光激发荧光,激发光波波长为488nm,发射光波波长大于630nm,产生红色荧光。分析蓝色荧光对红色荧光的散点图或地形图。结果判断:在蓝色荧光对红色荧光的散点图上,结果为:正常细胞为低蓝光/低红光,凋亡细胞为高蓝光/低红光,坏死细胞为低蓝光/高红光。
四、注意事项
1.
在红色荧光对蓝色荧光散点图上,还可见到细胞凋亡区向细胞坏死区迁移的轨迹,可能是凋亡细胞的DNA进一步降解的缘故。
2. 用Heochst 33342 染料与细胞孵育的时间不宜过长,一般控制在20min 之内为宜。如果太长可引起Heochst33342 的发射光谱由蓝光向红光的迁移,导致红色荧光与蓝色荧光的比例改变,从而影响结果的判断。
3.Propidium Iodide (PI)有毒,操作时要戴手套。