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如何进行细胞染色 (2011-2-17)
如何进行细胞染色
 
I.细胞的染色例
 
1. 染色例1
以染色HeLa细胞为例,介绍使用如下试剂的方法
1). 试剂溶液的配制
     配制以下的储备液
     Calcein-AM          0.5 mg/ml DMSO solution
     BCECF-AM          1 mmol/l DMSO solution
     CFSE                   1 mg/ml DMSO solution
     CytoRed               1 mmol/l DMSO solution
     FDA                     0.5 mg/ml DMSO solution
     PI                         1 mg/ml H2O solution
     EB                        1 mg/ml H2O solution
     DAPI                    1 mg/ml H2O solution
     AO                       1 mg/ml H2O solution
* DMSO solution在-20℃的条件下保存,避免失效
 
2). 器具
     盖玻片 18 mm × 18 mm
     培养皿 (直径约35 mm)
     镊子
 
3). 操作
 1) 用5.0 ml PBS(-)溶解10 μl储备液,配制成染色液。
    *由于用DMSO溶解的储备液在水溶液中易分解,所以染
     色液要现配现用,放置长时间后不能染色。
 2) HeLa细胞用Trypsin-EDTA制成细胞悬液。
 3) 将细胞悬液离心分离(速度: 1,000 rpm,时间: 3分钟)。
 4) 去除上清液,加入PBS(-),控制细胞数量在105-106 个/ml。
 5) 用移液枪吹打充分。
 6) 在1.5ml微管中加入30 μl第4) 步得到的细胞悬液。
 7) 加入15 μl染色液。
 8) 盖上盖子,在37℃的条件下,孵育15-30分钟。
 9) 取10 μl第8) 步的染色溶液滴加在盖玻片上, 上面再覆盖
     另一张盖玻片。
10) 将盖玻片放在荧光显微镜下,用染色试剂对应的激发波
      长观察。
 
2. 染色例2
MitoRed染色细胞为例,介绍使用如下试剂的方法
1).试剂溶液的配制
     配制以下的储备液
     MitoRed 1 mmol/l DMSO solution
   (用78 μl DMSO溶解1支50 μg的MitoRed)
*DMSO solution在-20℃的条件下保存,避免失效
 
2). 操作
 1) 用培养基稀释1 mmol/l 储备液。MitoRed终浓度为:20-
     200 nmol/l
    *加入到细胞前,推荐先在37℃保温
 2) 在细胞培养板上培养细胞 (细胞浓度:1×105- 1×106个
     /ml)
 3) 去除培养基,用 (培养基:PBS,Hank,s溶液等)轻轻
     地清洗。
 4) 将稀释的试剂溶液添加至每孔,在培养条件下,培养
     30-60分钟。
 5) 去除含色素溶液的培养基,添加新的培养基。
 6) 用荧光显微镜观察。
 
固定细胞的时候,在第4) 步的操作后按以下步骤操作。
 5) 去除MitoRed溶液,用不含血清的培养基, PBS,
     Hank,s溶液清洗。
 6) 用10%中性 福尔马林缓冲液,固定15-20分钟。
 7) 用PBS清洗。
 8) 用荧光显微镜观察。
图P-7-1 j)   染色HeLa细胞的荧光图像。
 
3. 染色例3
    介绍以Hochest 33258,33342染色细胞为例
1). 试剂溶液的配制
     配制以下的储备液
     Hochest 33258 1 mg/ml H2O solution
     Hochest 33342 1 mg/ml H2O solution
     细胞固定液:1%戊二醛/PBS(-)
     培养液:PBS(-)
2). 操作
 1) 将含约1×106个细胞的细胞培养基离心5分钟
    (速度:400 x   ),去除上清液。
 2) 加入100 μl细胞固定液,采用吹打等方法,充分混合。
 3) 在室温下静置30分钟。
 4) 离心5分钟 (速度:400 x   ),去除上清液。加入1 ml
     PBS(-)混合后,再离心5分钟 (速度:400 x   )
    *此操作为了充分清洗掉戊二醛,如果存在戊二醛,会导致淬灭。
 5) 加入20 μl PBS (-),混合后加入4 μl荧光色素,再混合。
 6) 滴1滴细胞染色液在载玻片上,将盖玻片盖在上面。                 
 7) 用荧光显微镜观察。
     图P-7-1 k)、I)染色正常人胎儿细胞的荧光图像。