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  • 别      名: BLK-NH2
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Biotin Labeling Kit-NH2
货号: LK03

生物素标记试剂盒-氨基
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LK03: 3 samples1470现货

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特点:整个标记过程仅需1个小时

            整个标记过程在1支过滤管中进行

            荧光标记抗体回收率高 

            适用于50-200 μgIgG

 

该试剂盒主要用于制备生物素标记的蛋白质,用于酶免疫分析(EIA)。NH2-reactive biotin是试剂盒的成分之一,它含有琥珀酰亚胺基(NHS),能与蛋白质或者其它分子的氨基反应。该试剂盒中包含了标记所需的全部试剂,标记过程十分简便。只需将NH2-reactive biotin加入到IgG溶液中,37培养10分钟即可。每个IgG分子平均能够和5-8个生物素分子结合。过量的生物素分子能够使用过滤管将其除去。

备注:经过同仁化学研究所的长期稳定性考验,代码为LK03的产品在0-5℃未开封的条件下由原来可以保存半年延长至一年。

 

 

 

 

 

 

 

 

注意事项:
 用该试剂盒标记的蛋白质的分子量要>50,000。
 在标记过程中,IgG或者biotin-IgG标记物始终在Filtration tube的滤膜上。
 如果IgG溶液中含有分子量>10,000的其他蛋白质,如BSA或明胶时,在使用该试剂盒标记前,先要纯化IgG溶液。IgG溶液能够用IgG Purification Kits(不包含于本试剂盒中)来纯化。
 如果IgG溶液含有小的不溶物,离心后取上清液来进行标记。

 如果长时间不使用,建议您把试剂盒中的标记试剂NH2-reactive biotin放在-20℃冰箱中保存,不需要充氮气,可以更好地保持标记试剂的活性,但请不要把其它试剂和过滤管放到-20℃冰箱中,仍请放在0-5℃冰箱中保存。

 

标记IgG操作步骤
(1)将100 μl WS buffer以及含有100 μg IgG的样品溶液加入到过滤管中。a)
(2)8,000-10,000 g离心10分钟。b)
(3)将10 μl DMSO加入到NH2-reactive biotin中并用移液器吹打使其溶解。c)
(4)将100 μl Reaction buffer以及8 μl NH2-reactive biotin溶液加入到过滤管中,吹打使其混合。d)
(5)将过滤管放入培养箱中,37℃培养10分钟。
(6)将100 μl WS buffer加入到过滤管中,8,000-10,000 g离心10分钟,b)除去滤液。
(7)将200 μl WS buffer加入到过滤管中,8,000-10,000 g离心10分钟,b)重复该步骤一次。
(8)将200 μl WS buffer加入到过滤管中吹打10-15次来回收标记产物。e)将该溶液转移到0.5 ml试管中,在0-5℃下保存。

 

a)样品溶液的体积不应超过100 μl。如果抗体浓度低于1 mg/ml,重复步骤1和2直至总的IgG聚积量达到100 μg。如果聚积过程中滤液的体积超过400 μl,则在进行后续的离心操作前应除去滤液。
b)如果溶液在离心后仍然残留在膜上,可以再离心5分钟或者适当增加转速。
c)NH2-reactive biotin在管子的底部,向管底加入10 μl DMSO,吹打数次使其溶解。
d)如果IgG的量为200 μg,在步骤4时加入所有的NH2-reactive biotin溶液。
e)并不一定要使用WS buffer来回收标记产物,可以选择任何适合于该实验的缓冲液来替代。

 

生物素/蛋白质 比率的测定每个IgG平均可以和5-8个生物素结合。如果需要知道精确的结合数的话,可以做一下HABA试验。参照以下HABA试验的操作说明。

 

用HABA法计算蛋白质的生物素标记率

1. 原理

   生物素对蛋白质的标记率采用HABA(4-Hydroxy-azobenzene-2’-carboxylic acid)的方法计算。

   HABA和亲和素结合后在500 nm会有吸收。由于生物素-亲和素的亲和性比HABA-亲和素的高,所以在HABA-亲和素溶液中加入生物素标记蛋白,生物素会取代HABA和亲和素结合。因为HABA和亲和素解离会导致在500 nm的吸光度减少,故利用此原理可以计算生物素的标记率。

2. 试剂

   • 亲和素 :10 mg

   • HABA  : 14 mg

   • DMSO :500 μl

   • PBS buffer(pH 7.4):20 ml

8.0 g/l NaCl,0.2 g/l KCl,1.15 g/l Na2HPO4,0.2 g/l KH2PO4

3. 测定及计算方法

1) 在2 ml样品管中精确称量14.0 mg HABA后,用移液器加入500 μl DMSO溶解制成HABA溶液。

2) 在20 ml容量瓶中精确称量10.0(±0.1) mg 亲和素后,加入15 ml PBS溶解。然后用移液器加入200 μl上述配制好的HABA溶液后,补充PBS至20 ml,充分混合,制成HABA-亲和素溶液。

3) 用移液器吸取900 μl配制好的HABA-亲和素溶液至微型比色槽( 容量1 ml,长1 cm)中,测定在500 nm的吸光度,重复测定3次的平均值作为AbsA,这时的AbsA值大约为1.5。

4) 用移液器吸取900 μl配制好的HABA-亲和素溶液至2 ml样品管中,然后加入100 μl纯化的标记蛋白质溶液,旋紧盖子后,用Vortex混匀。

5) 静置5 min(以上),用移液器转移至微型比色槽中,测定在500 nm的吸光度,作为AbsB。如果蛋白质浓度过高,会造成生物素比亲和素多,有时会出现无法计算出和蛋白质结合的准确生物素数量的情况。所以如果AbsB<0.7,建议先适当稀释蛋白质溶液(稀释倍率:Z),然后加入HABA-亲和素溶液,计算出标记率。

6) 按照以下公式计算出样品中的生物素浓度B(mol/l)。

     B(mol/l)=Z×[10-2×(0.9×AbsA-AbsB)/34]

7) 也可以计算出1个分子蛋白质上结合的生物素数量。例如按照Ⅳ.用Biotinylation Kit(Sulfo-OSu)中的生物素标记方法,标记X g分子量为MWprotein的蛋白质,纯化后的蛋白质浓度A(mol/l)可以表示如下:

     A(mol/l)=(X/MWprotein) ×103

在1个分子蛋白质上结合的生物素数量(mol/mol)=B/A。

1.能够用这个试剂盒标记其他蛋白质吗?

可以。只要标记分子的分子量>50,000。

2.标记蛋白之前是否必须使用过滤管?

如果蛋白溶液中不含有带有氨基的小分子且蛋白浓度在10 mg/ml或者70 μM左右时,可以不使用过滤管来过滤,只需要将10 μl 样品溶液和90 μl Reaction Buffer混合,将混合液加入到NH2-reactive biotin管中。反应后,将反应液移入过滤管中,并从步骤6开始按照操作说明上的方法做后续试验。

3.是否必须要用WS buffer来储存标记产物?

不一定要使用WS buffer,可以使用任何适合该实验的缓冲液。

4.我的样品溶液中含有小的不溶物,应该怎么办?

低速离心后取上清液进行标记。

5.标记产物能保存多久?

在0-5℃下能够保存2个月。如果需要保存更久,可以添加等量的丙三醇,并在-20℃下(只要该蛋白可以冷冻)存放。但是,还要注意样品自身是否稳定。

6.用该试剂盒所能标记的IgG的最小量是多少?

IgG的最小量为10 μg。10 μg-100 μg的IgG的标记比率是一样的。