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Cell Counting Kit-8(CCK-8)
货号: CK04

细胞增殖/毒性检测试剂盒(CCK-8)
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《原理图》
Ⅰ. 概述:Cell Counting Kit-8 (CCK-8) 利用了Dojindo开发的水 溶性四唑盐 — WST®-8 (2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3- (4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐),它 在电子载体1-Methoxy PMS存在的情况下能够被还原 成水溶性的甲臜染料。 CCK-8溶液可以直接加入到细胞样品中;不需要预配 各种成分。CCK-8法是用于测定细胞增殖或毒性实验 中活细胞数目的一种高灵敏度,无放射性的比色检测 法。WST®-8被细胞内脱氢酶氧化还原后生成的橙黄 色甲臜染料能够溶解在组织培养基中,生成的甲臜量 与活细胞数量成正比。
 
Ⅱ . 操作步骤
Ⅲ. 注意事项
1. 首次实验时,建议参考文献上的实验条件或做预实验摸索接种细胞的数量和加入CCK-8试剂后的显色时间。方法:取已知细胞数量的细胞悬液加入到培养板中,然后用培养基依次等比例稀释成一个系列浓度的细胞悬液,细胞培养一段时间后加CCK-8试剂,继续培养,过0.5-1 h,从培养箱中取出培养板观察颜色是否发生明显变化?如果没有,放入培养箱中继续培养,过1 h左右从培养箱中拿出观察颜色变化⋯⋯直到颜色发生明显梯度变化后,用酶标仪进行测定,并记录下反应时间。
2. 根据实验设计的天数,若是细胞增殖实验,一般选取O.D.值在0.2-1.0 (扣除空白后) 范围内的细胞数量;若是做药物对细胞的毒性实验,一般选取O.D.值在1.0-2.0 (扣除空白后) 范围内的细胞数量。但也存在有部分细胞的O.D.值达不到1.0的情况。
3. 接种时请充分混匀细胞悬液,保证每孔接种细胞数量接近一致。如果细胞容易聚团,建议每接种几个孔后,将细胞悬液重新混匀后再接种。
4. 培养时培养板边缘孔内的培养基易挥发,为了减少误差,建议培养板边缘孔只加培养基,而不作为指标检测孔。
5. 为了减少差异,请尽量采用多通道移液器。加入CCK-8时,建议45°斜贴培养板孔壁加样,切勿直接插入培养基液面下,否则容易产生气泡,影响检测结果。
6. CCK-8试剂加入时需快速,尽可能减少试剂在移液器上的残留所带来的误差,也可用培养基稀释CCK-8试剂1倍,混匀后每孔加入20 l,减小复孔间误差。
7. 加完CCK-8后,请轻微倾斜培养板使培养基覆盖培养板孔壁上残留的CCK-8,并轻轻拍打培养板使CCK-8和培养基混匀。如果培养基需要换液,可将CCK-8与培养基按照1:10的比例混匀后添加。
8. 试剂中所含的WST®-8会与还原剂反应,生成WST®-8甲臜从而影响实验结果。若实验中所采用的药物具有还原性,请在加入CCK-8前进行换液。
9. 若细胞培养时间较长,培养基颜色、pH值等条件易发生改变,此时加入CCK-8前需换液。
10. 如果样品为高浑浊度的细胞悬液,建议采用双波长进行测定,检测波长450-490 nm,600-650 nm作为参比波长。
11. 由于CCK-8几乎无细胞毒性,细胞可在实验后进行中性红法或结晶紫法等其他实验。
12. 如果要测定细胞的具体数量,建议先做标准曲线。
 
Ⅳ. 参考文献
1. Kie Kyon Huang, et al., Genomic and Epigenomic Profiling of High-Risk Intestinal Metaplasia Reveals Molecular Determinants
of Progression to Gastric Cancer, Cancer Cell, 2018, 33, 1-14
2. TaChung Yu, et al., Fusobacterium nucleatum Promotes Chemoresistance to Colorectal Cancer by Modulating Autophagy,
Cell, 2017, 170(3), 548-563
3. Kun Chen, et al., Methyltransferase SETD2-Mediated Methylation of STAT1 Is Critical for Interferon Antiviral Activity,
Cell, 2017, 170(3), 492-506
4. Liang Huang, et al., Integrated genomic analysis identifies deregulated JAK/STAT-MYC-biosynthesis axis in aggressive
NK-cell leukemia, Cell Research, 2017, 1-15
5. Christian Münchet, et al., Mitochondrial unfolded protein response controls matrix pre-RNA processing and translation,
Nature, 2016, 534, 710-713
6. Kazuhide Hayakawa, et al., Transfer of mitochondria from astrocytes to neurons after stroke,
Nature, 2016, 535, 551-555
7. Yoon Kyung Choi, et al., Dual effects of carbon monoxide on pericytes and eurogenesis in traumatic brain injury,
Nature medicine, 2016, 22(11), 1335-1341
8. Akihiro Fujimoto, et al., Whole-genome mutational landscape and characterization of noncoding and structural mutations
in liver cancer, Nature genetics, 2016, 48(5), 500-509
9. Jian Zheng, et al., Pancreatic cancer risk variant in LINC00673 creates a miR-1231 binding site and interferes with PTPN11
degradation, Nature genetics, 2016, 48(7), 747-757
10. Wen-Lian Chen, et al., Enhanced Fructose Utilization Mediated by SLC2A5 Is a Unique Metabolic Feature of Acute Myeloid
Leukemia with Therapeutic Potential, Cancer Cell, 2016, 30, 779-791
 
1.一个孔中应接种多少个细胞?

当使用标准96孔板时,贴壁细胞的最小接种量至少为1,000 个/孔 (100 μl 培养基)。检测白细胞时的灵敏度相对较低,因此推荐接种量不低于2,500 个/孔 (100 μl 培养基)。如果要使用24孔板或6孔板实验,请先计算每孔相应的接种量,并按照每孔培养基总体积的10%加入CCK-8溶液。

2.能否用384孔板进行试验?

可以。向各孔中加入培养基体积10%的CCK-8溶液,如果加入的CCK-8体积太少,可以先将CCK-8溶液稀释1倍,然后加入培养基体积20%的量。

3.能否用24孔板进行试验?

可以。向各孔中加入培养基体积10%的CCK-8溶液。

4.酚红会影响检测吗?

不会。培养基中酚红的吸光度可以在计算时,通过扣除空白孔中本底的吸光度而消去,因此不会对检测造成影响。

5.CCK-8与胸苷结合检测之间是否有相关性?

有。然而,请注意由于CCK-8使用的检测原理与胸苷检测的不同,因此结果可能不同。

6.CCK-8能否检测细菌细胞?

可以检测E.coli,但不能检测酵母细胞。向100 μl E.coli培养液中加入10 μl CCK-8溶液,并培养1-4个小时或过夜。

7.CCK-8稳定吗?

CCK-8很稳定,在避光0-5℃条件下可以保存2年。

8.如果没有450 nm的滤光片,还可以使用哪些其他滤光片?

还可使用450 nm到490 nm之间的滤光片。

9.如何减少由于CCK-8试剂在枪头上或孔壁上的残留所带来的误差?

可以在加样前用培养基稀释CCK-8试剂并混匀后加样。

10.CCK-8是什么颜色?

应该是粉红色。若颜色不一样,有可能会影响测定。

11.CCK8能否对活细胞进行染色?

不能。因为CCK8的主要成分是一种水溶性的四唑盐 (WST8),并通过电子载体1Methoxy PMS将活细胞中的电子交换到培养基中的WST8上。由于生成的甲ā也是高度水溶性的,因此CCK8不能对细胞进行染色。

12.CCK8检测溶液对细胞是否有毒?

CCK8溶液自身因为高浓度的1Methoxy PMS的存在而具有一点毒性。但是,加到培养基中的CCK8是没有毒性的,因为被稀释了10倍。因此,长时间的培养,如过夜或者培养数天是可以的。同一个细胞培养液在CCK8检测后还可以用于其他细胞增殖检测,如结晶紫检测,中性红检测或者DNA荧光检测等。由于每种细胞对于CCK8的耐受力都不同,因此在需要进行长时间培养时,先检测一下细胞在加入CCK8培养后的活力。

13.在做加药实验时,药物对测定是否有影响?如何解决?

有时会有影响。如果药物具有还原性,会和CCK8发生显色反应,增加吸光度。解决办法:首先要确认药物是否有吸收,在含有药物的培养基中加入CCK8,测定450 nm的吸光度,如果它的吸光度比不含药物的培养基 (加CCK8)的吸光度高,则证明药物有影响,可在加CCK8之前更换培养基,去掉药物的影响。

14.每次测定的数值不一样,是什么原因?如何解决?

可能会有以下几个原因: 1. 当在培养箱内培养时,培养板最外一圈的孔最容易干燥挥发,由于体积不准确而增加误差。 一般情况下,最外一圈的孔只加培养基,不作为测定孔用。 2. 有可能会因为CCK8沾在壁上而产生误差,建议在加入CCK8后,轻轻敲击培养板以帮助混匀。 3. 每孔的细胞数量过多或过少。请预先在1,000100,000个/孔范围内摸索条件。

15.如何设定空白对照?

在不含细胞的培养基中加入CCK8,培养一定的时间,测定450 nm的吸光度即为空白对照。在做加药实验(细胞毒性实验)时,还应考虑药物的吸收,可在不含细胞,加入药物的培养基中加入CCK8,培养一定的时间,测定450 nm的吸光度作为空白对照。

16.哪些物质会影响CCK8的测定?

当有还原性物质存在时会影响CCK8的测定,例如含有维生素C的Glucose等 (一般培养基中的量不多,酚红或血清不影响测定)。在有酚红存在的情况下,会增加空白吸收,但不影响测定,扣除空白吸收即可。

17.在实验中吸光度值太高,如果不能减少细胞数量,如何解决?

可以缩短加入CCK8后的培养时间。例如:可以把加入CCK8试剂后的培养时间由2小时缩短为1小时。

18.设定参比波长的目的是什么?必须设定吗?

不一定要设定。CCK-8试剂在参比波长没有吸光度。设定参比波长的目的是为了取出由于样品混浊所带来的吸收。

19.说明书上仅写了96孔板的测定方法,如果使用24孔板货12孔板,应该加多少量CCK-8试剂?…

一般情况下建议加入CCK-8试剂的量是培养基体积的1/10。

20.在CCK-8显色过程中,如何终止反应?

有一下几种方法(96孔板): 1、 在显色反应后,将培养板放置4℃冰箱内。 2、 每孔加10 μl 0.1 M HCL溶液。 3、 每孔加10 μl 1%(w/v)的SDS(十二烷基硫酸钠)溶液。注意:反应停止后,应在24小时之内测定。

21.必须预培养细胞吗?

不一定。如果要向保持细胞的最好状态,建议预培养细胞。如果不做细胞预培养,细胞内的脱氢酶可能会不稳定。也有人不做细胞预培养,但在做标准曲线和检测时需要统一检测条件。

22.如果加入的药物中含有金属,是否会有影响?

金属对CCK-8显色有影响。当终浓度为1 Mm的氯化亚铅、氯化铁、硫酸铜会抑制5%、15%、90%的显色反应,使灵敏度降级。如果终浓度是10 Mm的话,将会100%抑制。

23.CCK-8试剂的保存条件?

在避光0-5℃条件下可以保存2年。

24.预培养后,更换培养基需要细胞计数吗?

一般情况下用胰蛋白酶处理对数增长期的细胞,用血球计数盘计数,制备成一定浓度的细胞悬液即可。如果想要精密计数细胞的话,可以预培养后取培养基用血球计数盘进行计数。

25.CCK-8对于不同的细胞,灵敏度是否一样?

不一样,悬浮细胞与贴壁细胞相比较难染色。对于贴壁细胞,一般加入CCK-8培养1-4小时吸光度已经很高,但对于悬浮细胞则可能吸光度较低,可以通过延长CCK-8的加入时间或增加细胞数量来解决。

26.悬浮细胞和贴壁细胞在数量上有何区别?

悬浮细胞由于染色比较困那,一般需要增加细胞数量和延长培养时间。贴壁细胞染色比较容易,若细胞数量过大,有时吸光度会超过酶标仪的读数。

27.应该每次做标准曲线吗?

建议每次做。虽然细胞是一样的,但是细胞的状态不一定一样,对于状态不一样的细胞,建议每次做标准曲线。如果试剂的批号不一样,灵敏度可能会有轻微的差异,对于不同的批号建议分别做标准曲线。

28.有时在药物作用情况下,细胞已经死亡,但是脱氢酶的活性还在,是否能计算细胞数量?…

不能。由于CCK-8是通过和细胞内的脱氢酶进行反应间接反映活细胞数量,如果细胞已经死亡,但脱氢酶的活性还在,则试剂测定的细胞数量将会比真实值高,不能真实反映活细胞数量,建议采用别的方法测定。

29.实验之前,是否需要先检测一下培养基和CCK-8是否会反应?

建议使用一个孔作一下检测,因为有培养基中可能含有氧化还原反应的物质,在正式实验之前有必要先确认培养基和CCK-8是否反应。一般正常在的OD值应该在0.4以下。