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HiLyte Fluor TM 647 Labeling Kit-NH2
货号: LK15

HiLyte Fluor 647标记试剂盒-氨基
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3 samples2540现货

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特点:整个标记过程仅需1个小时                

            整个标记过程在1支过滤管中进行            

            荧光标记抗体回收率高 

            适用于50-200 μgIgG

 

NH2-reactive HiLyte FluorTM * 647是试剂盒的成分之一,它有一个琥珀酰亚胺基(NHS),能与蛋白质或者其它分子的氨基反应。该试剂盒中包含了标记所需的全部试剂。每一管NH2-reactive HiLyte FluorTM 647最多能够标记200 μgIgG,每个IgG分子可与4-6HiLyte FluorTM 647分子共价结合。标记过程十分简单,只需要在特制的过滤膜上将NH2-reactive HiLyte FluorTM 647加入到IgG溶液中,然后在37下培养10分钟。过量的HiLyte FluorTM 647能够用过滤管除去。被HiLyte FluorTM 647标记后的IgG的激发和发射波长分别为652 nm673 nm
* HiLyte FluorTM
AnaSpec,Inc公司的商标 

 

注意事项:
 
用该试剂盒标记的蛋白质的分子量要>50,000
 
在标记过程中,IgG或者HiLyte FluorTM 647-IgG标记物始终在Filtration tube的滤膜上。
 
如果IgG溶液中含有分子量>10,000的其他蛋白质,如BSA或明胶时,在使用该试剂盒标记前,先要纯化IgG溶液。IgG溶液能够用IgG Purification Kits(不包含于本试剂盒中)来纯化。
 
如果IgG溶液含有小的不溶物,离心后取上清液来进行标记。

标记IgG操作步骤
1)将100 μl WS buffer以及含有100 μg IgG的样品溶液加入到过滤管中。a
28,000-10,000 g离心10分钟。 b
3)将10 μl DMSO加入到NH2-reactive HiLyte FluorTM 647中并用移液器吹打使其溶解。c
4)将100 μl Reaction buffer以及8 μl NH2-reactive HiLyte FluorTM 647溶液加入到过滤管中,吹打使其混合。d
5)将过滤管放入培养箱中,37培养10分钟。
6)将100 μl WS buffer加入到过滤管中,8,000-10,000 g离心10分钟,b除去滤液。
7)将200 μl WS buffer加入到过滤管中,8,000 g离心10分钟,b重复该步骤一次。
8)将200 μl WS buffer加入到过滤管中吹打10-15次来回收标记产物。e将该溶液转移到0.5 ml试管中,在0-5下保存。

a)样品溶液的体积不应超过100 μl。如果抗体浓度低于1 mg/ml,重复步骤12直至总的IgG聚积量达到100 μg。如果聚积过程中滤液的体积超过400 μl,则在进行后续的离心操作前应除去滤液。
b
)如果溶液在离心后仍然残留在膜上,可以再离心5分钟或者适当增加转速。
c
NH2-reactive HiLyte FluorTM 647在管子的底部,向管底加入10 μl DMSO,吹打数次使其溶解。
d
)如果IgG的量为200 μg,加入所有的NH2-reactive HiLyte FluorTM 647溶液。
e
)并不一定要使用WS buffer来回收标记产物,可以选择任何适合于该实验的缓冲液来替代。

 

HiLyte FluorTM 647/IgG比率的测定
测定HiLyte FluorTM 647标记抗体溶液在280 nm以及652 nm处的吸光度,用以下公式计算比率:
比率(每个IgG分子结合的HiLyte FluorTM 647分子数)=0.85×A652/A280-0.08×A652

A652652 nm处的吸光度       A280280 nm处的吸光度

1.能够用这个试剂盒标记其他蛋白质吗?

可以。只要标记分子的分子量>50,000。

2.标记蛋白之前是否必须使用过滤管?

如果蛋白溶液中不含有带有活性氨基的小分子且蛋白浓度在10 mg/ml或者70 μM左右时,可以不使用过滤管来过滤,只需要将10 μl 样品溶液和90 μl Reaction Buffer混合并加入 8 μl NH2-reactive HiLyte FluorTM 647(由步骤3所得)混合并从步骤4开始按照操作说明上的方法做后续试验。

3.标记产物能保存多久?

在4℃下能够保存2个月。如果需要保存更久,可以添加100%体积的丙三醇,并在-20℃下存放。但是,还要注意样品自身是否稳定。

4.用该试剂盒所能标记的IgG的最小量是多少?

IgG的最小量为10 μg。如果需要标记的IgG的量小于20 μg,请在步骤4时,参照操作说明加入4 μl NH2-reactive HiLyte FluorTM 647而不是8 μl。

5.能够使用这个试剂盒标记寡核苷酸或者寡肽吗?

不行。寡核苷酸或者寡肽可能因为分子量太小而不能存在于滤膜上。