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  • 别      名: PLK-NH2 (for 1mg)
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  • 储存条件: 0-5
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Peroxidase Labeling Kit-NH2 (for 1mg)
货号: LK51

辣根过氧化物酶标记试剂盒-氨基
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LK51: 1 sample2280现货

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特点:整个标记过程仅需3个小时
         整个标记过程在1支过滤管中进行
         酶标抗体回收率高
 
该试剂盒主要用于制备酶免疫分析 (EIA) 所需的辣根过氧化物酶标IgG以及竞争性EIA所需的辣根过氧化物酶标抗原。该试剂盒中的NH2-reactive peroxidase具有琥珀酰亚胺基 (NHS),它能够与含有NH2的蛋白质或者其他分子反应。该试剂盒包含了标记过程中所需的所有试剂,包括储存用缓冲液。标记过程相当简单:只需将IgGNH2-reactive peroxidase混合并且在37下培养2小时。NH2-reactive peroxidase不需任何活化就可以和靶分子形成共价键。NHS与辣根过氧化物酶之间的距离大约为1.2 nm,为辣根过氧化物酶分子半径的一半。因此,当辣根过氧化物酶标IgG用于EIA时,NH2-reactive peroxidase的高效性足以使它在标记后省去纯化的过程。即使在标记后需要有一个高纯度的精制过程,也只要用亲和柱或凝胶渗透柱就能简单达到目的。在标记小分子的时候,使用试剂盒中包含的过滤管即可除去分子量较大的分子。由于NH2-reactive peroxidase自身的氨基已经被阻断,因此自身不会发生反应。
试剂盒内含
3 samples
NH2-reactive peroxidase...........100 µg × 3        Washing buffer...........4 ml × 1
Reaction buffer.........................200 µl × 1          Storage buffer.............4 ml × 1
Filtration tube............................3                 
 
1 mg
NH2-reactive peroxidase..........1 mg × 1          Washing buffer..........10 ml × 1
Reaction buffer.........................1.2 ml × 1        Storage buffer............10 ml × 1
Filtration tube...........................1                      15 ml tube..................1
 
注意事项:
所需标记的较大的蛋白质的分子量要>50,000
所需标记的较小的氨基化合物的分子量要<5,000
标记过程中,标记前后的IgG总是在过滤管的滤膜上。
如果IgG溶液含有其它分子量超过10,000的蛋白质,如BSA或凝胶,在使用该试剂盒标记前请先纯化IgG溶液。IgG溶液能够使用IgG纯化试剂盒来纯化(不包含于此试剂盒中)。如果IgG溶液中含有小的不溶物,离心后提取上清液来标记。
如果长时间不使用,建议您把试剂盒中的酶NH2-reactive peroxidase放在-20冰箱中保存,不需要充氮气,可以更好地保持酶的活性,但请不要把其它试剂和过滤管放到-20冰箱中,仍请放在0-5℃冰箱中保存。
 
所需设备仪器
3 samples:微型离心机,10 µl 50-200 µl移液器,37培养箱,0.5 ml微试管
for 1 mg:适用15 ml离心管的离心机,50-200 µl以及1 ml的移液器,37培养箱,微试管
 
标记机理
标记IgG操作步骤:
1)将100 μl Washing buffer以及含有50-200 μg IgG的样品溶液加入到过滤管中。a
28,000-10,000 g离心10分钟后,加入100 μl Washing buffer再离心一次。b
3)将10 μl Reaction buffer加入到NH2-reactive peroxidase中并用移液器吹打使其溶解。
4)将含有NH2-reactive peroxidase的溶液转移到IgG所集中的过滤管的滤膜上。
5)用移液器吸取溶液吹吸净整个滤膜表面,然后将过滤管放入培养箱中,37培养2小时。
6)将100 μl Washing buffer加入到过滤管中。如果滤液的体积超过300 μl,在进行步骤7前需要先丢弃滤液。
78,000-10,000 g离心10分钟。b
8)加入200 μl Storage buffer并用移液器吹打1015次来回收标记产物。c将溶液转移至0.5 ml的试管中,并储存于0-5℃下。d
a
)推荐的IgG的量为100 μg,样品溶液的体积不应超过100 μl。如果抗体浓度低于0.5 mg/ml,重复步骤12直至总的IgG聚积量达到50-200 μg。如果在聚积过程中,滤液体积达到或超过了400 μl,则需在进行下一步离心前将滤液除去。
b
)如果溶液在离心后仍然残留在膜上,可以再离心5分钟或者适当增加转速。
c
)标记产物的浓度为0.5-1.3 mg/ml。在进行后续的酶免疫,免疫印迹,免疫转染试验前先要将标记后的IgG稀释至适当的浓度。每个IgG分子上会被标记上1-3个辣根过氧化物酶分子。没有被结合的辣根过氧化物酶不会干扰正常的免疫试验。如果一定要纯化的话,可以使用凝胶渗透柱或亲合柱。
d
)通常,辣根过氧化物酶标记后的IgGStorage buffer中,0-5℃下至少能够保存2个月,如果需要保存更久,可以添加等量的丙三醇(终浓度:50%),并在-20下存放。但是,还要注意样品自身是否稳定。
 
标记小分子操作步骤:
1)用Reaction buffer制备50 μl1 mM的氨基化合物,a并将该溶液加入到NH2-reactive peroxidase管中。吹打数次使其充分混合,然后置于37下培养1小时。
2)将100 μl Washing buffer加入到反应液中并将整个溶液全部移入过滤管中。
3)在8,000-10,000 g 离心10分钟,b弃滤液,向管中加入200 μl Washing buffer。再重复该过程一次,然后再在8,000-10,000 g 离心10分钟。b
4)加入200 μl Storage buffer并用移液器吹打1015次来回收抗体。c)将溶液转移至0.5 ml的试管中,并储存于0-5℃下。d
a
)如果氨基化合物在水溶液中无法溶解,可以用DMSO使其溶解,制备成10 mM的溶液,取5 μl 45 μl Reaction buffer混合。
b
)如果溶液在离心后仍然残留在膜上,可以再离心5分钟或者适当增加转速。
c
)标记产物的浓度大约为400-500 μg/ml (10-12.5 μM)1-2个靶分子能够和1个辣根过氧化物酶分子结合。
d
)标记后的小分子在0-5℃下能够存放至少6个月。
 
辣根过氧化物酶-IgG 结合物的HPLC分析:
1)蛋白质:兔IgG100 μg
HPLC
条件
…………………………TSK凝胶柱,G3000 PWXL, 30 cm × 7.8 mm
流速………………………0.8 ml/min
流动相……………………10 mM的磷酸缓冲液,pH 7.0
柱温………………………28℃
加样量…………………… 20 μl