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Peroxidase Labeling Kit-SH
货号: LK09

辣根过氧化物酶标记试剂盒-巯基
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3 samples2240现货

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特点:整个标记过程仅需3个小时                   

            整个标记过程在1支过滤管中进行            
            
酶标抗体回收率高

 

该试剂盒主要用于制备酶免疫分析(EIA)所需的辣根过氧化物酶标IgG以及竞争性EIA所需的辣根过氧化物酶标抗原。该试剂盒中的SH-reactive peroxidase能够与含有巯基的蛋白质或者其他分子反应。该试剂盒包含了标记过程中所需的全部试剂,包括还原剂和储存用缓冲液。SH-reactive peroxidase可以和靶分子形成共价键,还原剂能够在IgG分子上建立自由巯基。当辣根过氧化物酶标IgG用于EIA时,SH-reactive peroxidase的高效性足以使它在标记后省去纯化的过程。即使在标记后需要有一个高纯度的精制过程,也只要用亲和柱或凝胶渗透柱就能简单达到目的。在标记小分子的时候,使用试剂盒中包含的过滤管即可除去分子量较大的分子。

试剂盒内含

SH-reactive peroxidase........100 µg × 3         Reducing agent..........3

Solution A............................4 ml × 1              Solution B..................1 ml × 1

Reaction buffer....................200 µl × 1          Storage buffer.............4 ml × 1

Filtration tube......................3

 

注意事项:
所需标记的较大的蛋白质的分子量要>50,000
所需标记的较小的巯基化合物的分子量要<5,000
标记过程中,标记前后的IgG总是在过滤管的滤膜上。
如果IgG溶液含有其它分子量超过10,000的蛋白质,如BSA或凝胶,在使用该试剂盒标记前请先纯化IgG溶液。IgG溶液能够使用IgG纯化试剂盒来纯化(不包含于此试剂盒中)。
如果IgG溶液中含有小的不溶物,离心后提取上清液来标记。
如果长时间不使用,建议您把试剂盒中的酶SH -reactive peroxidase放在-20冰箱中保存,不需要充氮气,可以更好地保持酶的活性,但请不要把其它试剂和过滤管放到-20冰箱中,仍请放在0-5冰箱中保存。

 

标记IgG操作步骤:
1)将100 μl Solution A以及含有50-200 μg IgG的样品溶液加入到过滤管中。a
2)用移液器使溶液混合,8,000-10,000 g离心10分钟。b
3)将150 μl Solution A加入到Reducing agent中并用移液器吹打使其溶解。
4)将100 μl步骤3所得溶液转移到IgG所集中的过滤管的滤膜上。
5)用移液器吹打数次,然后在37下培养30分钟。
6)将100 μl Solution B加入到过滤管中,8,000-10,000 g离心10分钟。除去滤液,加入200 μl Solution B,再离心一次。b
7)将50 μl Reaction buffer加入到SH-reactive peroxidase中并用移液器吹打使其溶解。
8)将SH-reactive peroxidase溶液移到被还原的IgG所集中的过滤管的滤膜上。
9)用移液器吹打数次,然后在37下培养1小时。
10)将100 μl Solution A加入到试管中,8,000-10,000 g 离心10分钟。b
11)加入200 μl Storage buffer并吹打10-15次来回收标记产物。c将此溶液转移至一支0.5ml的试管,并储存于0-5d
a
)推荐的IgG的量为100 μg,样品溶液的体积不应超过100 μl。如果抗体浓度低于0.5 mg/ml,重复步骤12直至总的IgG聚积量达到50-200 μg。如果在聚积过程中,滤液体积超过了400 μl,则需在进行下一步离心前将滤液除去。
b
)如果溶液在离心后仍然残留在膜上,可以再离心5分钟或者适当增加转速。
c
)标记产物的浓度为0.5-1.3 mg/ml。在进行后续的酶免疫,免疫印迹,免疫转染试验前先要将标记后的IgG稀释至适当的浓度。每个还原后的IgG分子上会被标记 12个辣根过氧化物酶分子。没有被结合的辣根过氧化物酶不会干扰正常的免疫试验。如果一定要纯化的话,可以使用凝胶渗透柱或亲合柱。
d
)通常辣根过氧化物酶标记后的还原型IgGStorage buffer中,0-5下至少能够保存2个月,如果需要保存更久,可以添加等量的丙三醇(终浓度:50%),并在-20下存放。另外,还要注意样品自身是否稳定。


标记小分子操作步骤:
1)用Reaction buffer制备50 μl1 mM的巯基化合物溶液,a并将该溶液加入到SH-reactive peroxidase管中。吹打数次使其充分混合,然后置于37下培养1小时。
2)将100 μl Solution A加入到反应液中并将整个溶液全部移入过滤管中。
3)在8,000-10,000 g 离心10分钟,b弃滤液,向管中加入200 μl Solution A。再重复该过程一次,然后再在8,000-10,000 g 离心10分钟。b
4)加入200 μl Storage buffer并用移液器吹打10-15次来回收抗体。c将此溶液转移至一支0.5 ml的试管中,并储存于0-5下。d
a
)如果巯基化合物无法在水溶液中溶解,可以用DMSO使其溶解,制备成10 mM的溶液,取5 μl 45 μl Reaction buffer混合。
b
)如果溶液在离心后仍然残留在膜上,可以再离心5分钟或者适当增加转速。
c
)标记产物的浓度大约为400-500 μg/ml10-12.5 μM)。12个靶分子能够和1个辣根过氧化物酶分子结合。
d
)标记后的小分子在0-5下能够存放至少6个月。

 

辣根过氧化物酶-IgG 结合物的HPLC分析:
1)蛋白质:兔IgG100 μg
HPLC
条件
………………………… TSK凝胶柱,G3000 PWXL, 30 cm × 7.8 mm
流速……………………… 0.8 ml/min
流动相…………………… 10 mM的磷酸缓冲液,pH 7.0
柱温……………………… 28
样品体积……………     20 μl

 

1.能够使用这个试剂盒标记F(ab’)2吗?

可以标记。请参照标记IgG的操作说明,回收率通常都超过80%。

2.能够用这个试剂盒标记其他蛋白质或者多肽吗?

可以,只要标记分子的还原型分子量>50,000或者<5,000且具有活性巯基结构。如果分子量.>50,000,参照IgG的标记操作说明,使用0.5-1 nmol蛋白样品用 LK09-10来标记。如果分子量<5,000,参照标记小分子的操作说明。如果分子量>5,000且<50,000,请咨询我们的客户服务。Email:info@dojindo.cn 免费电话 :800-988-0083

3.能够使用这个试剂盒标记寡核苷酸或者寡肽吗?

可以,只要它的分子量小于5,000且具有活性巯基。可以参照标记小分子的操作说明。

4.LK09所能标记的最小的IgG的量是多少?

最小量为50 μg。标记50 μg与200 μg之间的IgG,在灵敏度和本底上没有太大的区别。但是,在步骤8,使用SH-reactive peroxidase溶液时,用量缩小为原来的1/5,也能够标记10 μg的IgG。

5.每个IgG能够标记多少辣根过氧化物酶分子?

每个IgG平均能标记上1-2个辣根过氧化物酶分子。

6.标记蛋白质之前是否必须先使用过滤管?

如果蛋白溶液中不含有带有活性巯基的小分子并且蛋白浓度在10 mg/ml或者70 μM左右,则没有必要使用过滤管。只需要将样品溶液和Solution B混合,再把混合液加入到SH-reactive peroxidase管中即可。

7.是否必须要使用试剂盒所包含的Storage Buffer?

不一定要使用试剂盒所包含的Storage Buffer。可以选择任何适用于该试验的缓冲液。但是,Storage Buffer能够提高标记产物的稳定性。

8.我的样品中含有小的不溶物,我该怎么办?

低速离心后用上清液来标记。

9.标记反应结束后,未标记的SH-reactive peroxidase是否仍然含有活性马来酰亚胺?

不含有。几乎100%的SH-reactive peroxidase都被用于了IgG或者小分子的标记。

10.Storage Buffer中是否含有动物产品或者高分子聚合物?

Storage Buffer中不含有任何动物产品,高分子聚合物或者重金属离子。