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Cellular Senescence Detection Kit - SPiDER-βGal
货号: SG03

细胞衰老检测试剂盒
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5 assays1590现货

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 正常细胞的DNA损伤是由细胞的不断分裂和氧化应激引起。在没有修复DNA损伤的情况下,为了抑制 细胞的癌化,需要不可逆地终止DNA损伤细胞的分裂。细胞衰老是一种可以不可逆地终止DNA损伤细胞分 裂的状态,它可以抑制DNA受损细胞的生长。SA-β-gal (细胞衰老β-半乳糖苷酶) 在衰老细胞中过表达,被 广泛作为细胞衰老的标识之一。用X-gal染色检测SA-β-gal是一种常用的方法,但此方法存在几个缺点: 1) 由于细胞透膜性差,需要固定细胞。2) 由于很难区分染色细胞和未染色细胞,所以定量困难。3) 染色 时间长。 本试剂盒检测SA-β-gal灵敏度高,方法简便。SPiDER-βGal是一种检测β-gal的新型试剂,具有细 胞透膜性高,胞内荧光维持时间长的特点。本试剂盒不仅可以特异性地检测到活细胞中的SA-β-gal ( Bafilomycin A1抑制内源性β-galactosidase的活性),也可以检测到固定细胞中的SA-β-gal (McIlvaine 缓冲液 (pH 6.0)。由于SPiDER-βGalSA-β-gal反应后会产生很强且持续的荧光,因此SPiDER-βGal 被用于流式细胞仪来进行定量分析。
 1T. Doura, M. Kamiya, F. Obata, Y . Yamaguchi, T. Y. Hiyama, T. Matsuda, A. Fukamizu, M. Noda, M. Miura and Y. Urano, Angew. Chem. Int. Ed.,2016, 55, 9620.
Q: 本试剂盒的大概可以检测多少次?
 

A: 大概的检测次数,请参考下表中不同的使用容器:

 

35 mm dish

Micro Plate

Chamber Slide

使用次数

10 dishes

2 plates

7 slides

*使用次数会随着每孔添加的染色溶液量的变化而变化。使用前请先确认每孔的必要的染色溶液量。

Q: 为什么要添加Bafilomycin A1?
 

A:

    很多细胞内部都存在内源性β-半乳糖苷酶 (β-galactosidase),由于SPiDER-βGal与内源性β-半乳糖苷酶和细胞衰老的标记物SA-β-Gal都会发生反应。即使在没有衰老的细胞中,背景也较高,妨碍了SA-β-Gal的检测。

    Bafilomycin A1可以抑制溶酶体中的ATPase活性,并将溶酶体中的pH从酸性变为接近中性,从而降低了内源性β-半乳糖苷酶的活性。因此,在添加SPiDER-βGal之前先用Bafilomycin A1处理细胞,使得SPiDER-βGal可以与SA-β-gal反应,并对衰老细胞进行荧光染色。

    上图显示了添加和不添加Bafilomycin A1时检测SA-β-gal的差异。

    由于Bafilomycin A1也被用作自噬的抑制剂。使用时,请考虑是否会对实验体系有影响,如果有影响,建议固定细胞。细胞固定时,缓冲液会控制细胞内的pH,所以不需要使用Bafilomycin A1。可以参照操作说明书中的步骤进行染色。

 

Q: DMSO stock solution 可以稳定保存多久?
 

A: SPiDER-βGal DMSO stock solutionBafilomycin A1 DMSO stock solution配制后,-20℃可以稳定保存1个月。

Q: Working solution可以稳定保存多久?
 

A: SPiDER-βGal working solutionBafilomycin A1 working solution无法长期保存,请现配现用。

Q: 做细胞衰老的荧光观察时有哪些注意事项?
 

A: 随着细胞的衰老,被称为脂褐素(Lipofuscin)的不溶性物质会在细胞中积聚。 脂褐素自身会产生荧光,进而增加荧光背景。 在这种情况下,我们建议您准备不含SPiDER-βGal的样品,以准确评估衰老细胞中的SA-β-gal活性。

 

流式细胞仪检测

・测定“衰老细胞”和“正常细胞”的平均荧光强度(MFI

  ①添加了SPiDER-βGal的细胞

  ②未添加SPiDER-βGal的细胞 (背景)

・“①的平均荧光强度”减去“②的平均荧光强度”

  用扣除背景后的SA-β-gal的荧光来表征SA-β-gal的活性。

  aSA-β-gal活性(衰老细胞):①的平均荧光强度 - ②的平均荧光强度

  bSA-β-gal活性(正常细胞):①的平均荧光强度 - ②的平均荧光强度

通过比较上述ab的值来评价SA-β-gal的活性。

  另外,通过a减去b的差值可以确定细胞衰老所引起的SA-β-gal活性的变化。

 

荧光显微镜检测

・首先,使用未添加SPiDER-βGal的衰老细胞进行荧光观察。

・调整灵敏度(Gain等),直至来生自脂褐素的荧光(背景)不影响荧光图像为止

・在相同的成像条件下,对添加了SPiDER-βGal的细胞或正常细胞进行荧光观察。

 

Q: 细胞固定后还可以对SA-β-gal进行染色吗?
 

A: 可以。如果固定细胞,则不需要用Bafilomycin A1预处理细胞,但是需要制备pH调节至6Mcllvain Buffer。详细的操作请参考操作说明书。

 

Q: 请问是否有细胞固定后进行流式细胞仪操作的具体步骤?
 

A: 请参考下列实验步骤:

(1) 35 mm dish中播种细胞,37℃,5% CO2培养箱中过夜培养。

(2) 去除培养基,用2 ml HBSS清洗一次。

(3) 用胰蛋白酶消化,并用500 μl培养基回收细胞。

(4) 300×g离心5 min,去除上清。

(5) 100 μl 2% PFA/PBS重悬细胞,室温下5 min固定。

(6) 300×g离心5 min,去除上清。

(7) 500 μl HBSS重悬细胞,300×g离心5 min后,去除上清。本步骤重复2次。

(8) 加入500 μl SPiDER-βGal working solution(细胞固定用)37℃培养30 min

   *为了防止pH的变化,故不使用CO2培养箱。

(9) 300×g离心5 min,去除上清。

(10)500 μl HBSS重悬细胞,300×g离心5 min后,去除上清。本步骤重复2次。

(11)500 μl HBSS回收细胞,上流式细胞仪进行检测。

 

Q: 细胞固定后是否还可以进行SA-β-gal的检测和免疫染色?

A: 可以。但是请注意细胞固定可能会影响SA-β-gal(请参考下面的*2

   以下的实验例供作参考。

   WI-38细胞固定后,进行SA-β-gal检测和γ-H2AX (DNA损伤标志物)的免疫染色。

 

<实验操作>

(1) WI-38细胞播种至35 mm dish37℃,5% CO2培养箱中过夜培养。

(2) 去除上清,加入2 ml 4% Paraformaldehyde/PBS溶液,室温培养3 min*1

(3) 2 ml PBS清洗细胞3次。

(4) 添加2 ml SPiDER-βGal working solution *2, 37℃培养30 min*3

(5) 2 ml PBS清洗细胞2次。

(6) 加入2 ml 0.1% Tritox X-100/PBS, 室温培养30 min

(7) 2 ml PBS清洗细胞2次。

(8) 加入 2ml 1% BSA/PBS溶液,室温培养1 h

(9) 1% BSA/PBS溶液稀释过的抗γ-H2AX IgG(小鼠来源),加入至细胞后室温培养1 h

(10) 2 ml PBS清洗细胞3次。

(11) 1% BSA/PBS溶液稀释过的抗小鼠IgG(Cy5标记),加入至细胞后室温培养1 h

(12)去除上清,用2 ml PBS清洗细胞2次后进行荧光显微镜观察。

*1 细胞固定时间越长,对SA-β-gal活性的影响越高。

*2 细胞固定操作有可能会降低SA-β-gal的活性。如果检测SA-β-gal时,荧光强度较弱,请尝试将SPiDER-βGal DMSO stock solution 稀释500-1000倍使用。通常SPiDER-βGal DMSO stock solution 建议用Mcllvaine buffer (pH 6.0)稀释2,000倍使用。

*3 培养时不使用5% CO2培养箱。细胞固定后使用5% CO2培养箱的话,缓冲液会变为酸性,从而使得内在性β-galactosidase的活性上升,导致背景升高,无法辨别衰老细胞和年轻细胞的内的SA-β-gal活性的差值。

 

<实验数据>

1. 免疫染色前后SPiDER-βGal染色的荧光强度变化

 

通过比较免疫染色前后的SPiDER-βGal的荧光强度,可以发现固定后的免疫染色过程中SPiDER-βGal的荧光强度降低了。

2. 不同稀释倍率的SPiDER-βGal染色结果 (免疫染色后)

    红色:SPiDER-βGal  蓝色:γ-H2AX  <曝光时间: 1.5 s>

通过将SPiDER-βGal工作溶液的稀释比从2000倍更改为666倍,可以确认通过免疫染色(固定化)降低的SPiDER-βGal荧光强度与免疫染色前的强度相当。 

Q: 染色操作后发现荧光很弱,无法观察,请问是否有改善的方法?
 

A: 请确认如下三个注意事项。

   ①使用的滤光片是否与染色试剂匹配。

   <推荐的滤光片>

   · 荧光显微镜:激发(500-540 nm),荧光(530-570 nm)

   · 流式细胞仪:激发(488 nm), 荧光(500-540 nm)

   ②各working solution是否为现配现用。

   ③延长染色时间

     添加SPiDER-βGal working solution后,培养30 min后无法观察到荧光的话,考虑延长至45-60 min再进行荧光观察。

 

Q: 确认含有SA-β-Gal的细胞染色后,是否可以进行细胞固定?
 

A: 可以。建议使用4%的多聚甲醛进行细胞固定。

Q: 培养基中的血清和酚红是否会影响检测?
 

A: 培养基中的血清和酚红对SA-β-gal的检测没有影响。