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三种常用的细胞增殖、毒性检测方法的原理、特点与比较
    
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  同时检测LDH释放及活细胞(MTT、CCK-8等方法)的文献数量变化
                    (本数据由同仁化学研究所调查)

方法

MTT

CCK-8

LDH

产品

MTT

CCK-8CK04

Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST®(CK12)

检测对象

活细胞

活细胞

死细胞

检测结果

细胞存活率

细胞存活率

细胞死亡(损伤)

用途

细胞增殖毒性

细胞增殖毒性

细胞毒性、细胞损伤

底物

MTT

WST®-8

WST®

底物作用对象

线粒体内脱氢酶

细胞内脱氢酶

乳酸脱氢酶(LDH

检测方法

比色法

比色法

比色法

Formazan水溶性

不溶于水

溶于水

溶于水

优点

成本低

重现性好

无需使用放射性同位素51Cr

灵敏度高

适合做效靶细胞实验

操作简便

适合做ADCCCART实验

试剂稳定性高

试剂稳定性高

对细胞毒性小

对细胞毒性小

Formazan溶于水

 

适合高通量筛选

 

缺点

Formazan不溶于水,需用有机溶剂溶解

CCK-8试剂和酚红颜色接近,有时会有漏加或多加的情况

血清浓度高时会有干扰

对细胞有毒性

灵敏度比放射性同位素51Cr

操作繁琐,增加误差

不适合悬浮细胞

试剂需现配现用

产品性状

粉末

液体

液体、冻干粉

 
 MTT法检测原理:活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臜(Formazan),而死细胞无此功能。用DMSO溶解甲臜后在490nm波长处测定其吸光度值,可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内,MTT结晶形成的量与细胞数成正比。
       Cell Counting Kit-8(CCK-8)法原理CCK-8中的主要成分WST®-8能被细胞内的脱氢酶还原为水溶性的橙黄色甲臜,生成甲臜的量与细胞数成正比,可间接测定活细胞数量。
       乳酸脱氢酶(LDH)法检测原理:乳酸脱氢酶(LDH)是存在于细胞质的一种酶,当细胞膜受到损伤时,LDH 会释放到培养基中。由于释放出的LDH 稳定,检测培养基中LDH 的量可以作为测定死细胞和受损细胞数量的指标。
Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST®可以测定受损细胞所释放出的LDH,其原理是LDH 催化乳酸生成丙酮酸和NADH,NADH 通过电子载体可将水溶性四唑盐WST®(无色)还原成甲臜产物(橙色),WST®甲臜产物的吸光度与LDH 的量呈正比,利用此原理可以测定死细胞和受损细胞的数量。
         MTT法和CCK-8法反映的是细胞的存活率,虽然也可以间接反映细胞毒性,但当外在因素改变(线粒体)脱氢酶活性时,有时结果就会出现偏差。这时最好的方法是同时测定LDH的释放来验证细胞的损伤率,用2种方法来相互验证会使结果更可靠,更有说服力。
        在体外细胞损伤模型实验中,往往需要同时检测多种指标来验证,例如:细胞存活率(MTT法或
CCK-8法)、细胞凋亡(Annexin V-FITC)、细胞损伤(LDH法)、ROS、SODGSH、MDA、线粒体膜电位等指标。有关详细内容请参见体外细胞损伤模型的检测指标
  
  
【相关产品】
Cell Counting Kit-8(货号:CK04)                             
*:Cytotoxicity LDH Assay Kit- WST®  由于样品数量有限,先申请先得,发完为止,如未能申请到,敬请谅解。
〇 MTT
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使用Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST®的细胞损伤实验
 
  1960年Nachlas等进行了以乳酸脱氢酶(LDH)的释放为指标的细胞损伤实验后,以检测LDH作为一种确认细胞状态方法的相关文献在全球的数量越来越多(图1)。本次例举4篇近年发表过的文献,均通过检测LDH的释放确定细胞损伤率。
  Watanabe等研究水通道蛋白(AQP,膜蛋白质)的机理及与疾病的关联1)。已知AQP与细胞内水的转运有关,近年的研究表明,AQP也会透过甘油、H2O2等小分子,甚至对细胞增殖及迁移产生影响。Watanabe等为证实AQP-9对H2O2转运的影响,通过利用siRNA得到AQP-9基因沉默的HepG2细胞及H2O2荧光探针(CM-H2DCFDA)进行细胞对外源性H2O2的抑制实验。实验中,利Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST®测LDH的释放并确定由抑制H2O2转运引起的细胞伤率。结果,对照组正常细胞进行H2O2转运并检测到CM-H2DCFDA荧光,同时检测出LDH释放确认细胞受损。实验组细胞敲除AQP-9,细胞内没有检测出H2O2,并通过测定LDH的释放确认没有发生细胞损伤(图2)。
 
 
图2  检测AQP-9敲除的细胞内H2O2及LDH的释放
 
  Shu-fang Jin等研究突发性肺纤维化治疗药Pirfenidone(图3)的作用机能,其中合Cell Counting Kit-8(CCK-8)Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST®进行评价2)。结果Pirfenidone对老鼠纤维芽细胞C3H10T1/2的增殖及纤维化有一定抑制并能够增强激酶抑制剂XL413的效果,利CCK-8检测XL413加入前后,Pirfenidone对细胞增殖的抑制率,结Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST®确认细胞的增殖抑制并非由XL413本身引起。
 
 
图3  Pirfenidone及XL413的结构式
 
  此外,Liping Wu等研究弱酸刺激人上皮细胞(HEECs)ATP的释放,同时确认有无LDH释放增加3)。Wakatsuki等使用6-hydroxydopamine对原代神经细胞诱导凋亡后,以caspase3、Annexin VLDH为指标进行测定4)。对于细胞损伤而言,通过检测几种不同原理的指标进行实验结果的相互验证。同仁化学研究所生产并销售各类细胞增殖、毒性、损伤检测试剂盒及细胞染色等试剂,旨在以此帮助实验者阐明细胞内各类机理。
 
  
《参考文献》
 
1)  S. Watanabe, et al., Biochem. Biophys. Res. Com., 2016, 471, 191.
2)  S. Jin, et al., Exp. Cell. Res., 2015, 339, 289.
3)  L. Wu, et al., Am. J. Physiol. Gastroinest. Liver Physiol., 2015, 309, G695.
4)  S. Wakatsuki, et al., J. Cell. Biol., 2015, 211, 881.
 
技术支持:
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